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Western Blot, Southern Blot und DNA-Restriktionskarten

Western Blot

Allgemeines:

• Qualitativer / quantitativer Nachweis eines speziellen Proteins in einem Proteingemisch.
• Position auf dem Gel – Molekulargewichtsbestimmung (über Vergleichswerte).
• Grosse Sensibilität (Nanogramm).

Versuchsablauf:

• SDS-PAGE (Gelelektrophorese)
• Blotting (Transfer der Proteine auf Nitrozellulose-Folie)
• Sättigung der nicht-spezifischen (freien) Plätze auf der Nitrozellulose-Folie
• Detektion der spezifischen Proteine (Antikörper, Hormone, Enzyme)

Theoretische Grundlagen

• Transfer der Proteine, da sie auf dem Polyacrylamid-Gel nur schlecht zugänglich sind und zudem leicht aus dem Gel ausgewaschen werden können. Auf Nitrozellulose-Folie sind die Proteine besser zugänglich und zudem stärker gebunden.
• Sättigung der Nitrozellulose mit anderen (Dritt-)Proteinen (z.B. durch Kuhmilch), da sich sonst die Sonden auf der Folie festsetzen können und das Resultat verfälschen.
• 1. Inkubation mit spezifischen Antikörpern (ev. Antiserum) für gesuchte Proteine.
• 1. Auswaschung, damit nur die gebundenen Antikörper übrigbleiben
• 2. Inkubation mit spezifischem Antikörper gegen 1. Antikörper (markiert! - z.B. durch Enzym, dessen Produkt Licht absorbiert, d.h. farbig ist; auch radioaktive Markierung möglich, Nachweis durch Autoradiographie)
• 2. Auswaschung und Nachweis der 2. Antikörper durch Zugabe des Enzym-Substrates.

Anwendung von zwei Antikörpern, weil markierte Antikörper käuflich sind, vielleicht aber nicht direkt auf das gesuchte Protein passen. Umgehung über ersten Antikörper.

Versuchsmaterial Blotting:

• SDS-PAGE mit den Serumproteinen, aufgetrennt nach Grösse
• Nitrozellulose-Folie für Blotting (Elektrophorese)
• Ponceau S, um auf Nitrozellulose-Folie gewanderte Proteine anzufärben
• Kontroll-Färbung mit Coomassie-Blau auf Polyacrylamid-Gel, um nachzuweisen, dass alle Proteine geblottet wurden.

Versuchsmaterial Detektion:

• Sättigungs-Lösung - Milchpulver-Lösung
• 1. Antikörper – goat anti human transferrin
• 2. Antikörper – Antiserum der Maus gegen Schaf-IgG, gekoppelt mit Peroxidase-Enzym
• Visualisations-Lösung 1 – 1. Substrat der Peroxidase: H2O2
• Visualisations-Lösung 2 – 2. Substrat der Peroxidase: Chloronaphtol

DNA-Restriktionskarte

Theoretische Grundlagen

• Restriktionsendonucleasen schneiden DNA an ganz spezifischen Stellen (palindromische Struktur (z.B. EcoRI) - Polyklonierungsstellen).
• Auftrennung der DNA-Stücke der Grösse nach durch Gelelektrophorese
• Anfärben der DNA durch Ethidiumbromid (Fluoreszenz-Farbstoff).
• Rückschluss auf Reihenfolge der einzelnen DNA-Stücke – Restriktionskarte, Kenntnis über die einzelnen Schnittstellen auf dem DNA-Stück
• Spezielle DNA-Sequenzen werden durch Southern Blot gesucht

DNA-Klonierung

• Reine Fremd-DNA und DNA-Vektoren werden durch Ligasen an ihren palindromischen Strukturen miteinander verbunden (Klonierung).
• Transfektion von Bakterien mit den rekombinanten Plasmiden
• Selektion durch Antibiotika-Resistenz (Ampizillin)
• Multiplikation der Bakterien in Zellkulturen
• Reisolation des Plasmids bzw. des DNA-Fragments (Gelelektrophorese)

Anmerkungen:

• Plasmide sind zu einer autonomen Replikation, unabhängig vom Zellzyklus, befähigt – Ueberträger von Antibiotikaresistenzen.
• Transfektion – Uebertragung von rekombinanter DNA in eine Zelle (chemische, biologische und physikalische Methoden)
• Somatische Genmutationen: Krebs möglich
  Genmutationen in der Keimbahn: Erbkrankheiten (autosomal dominant / rezessiv oder X-chromosomal vererbbar).
• Multifaktorielle genetische Krankheiten: Bluthochdruck, Atherosklerose, Diabetes, Magengeschwüre, Hasenscharte etc. besitzen eine genetische Prädisposition (mehrere Gene sind dabei beteiligt), welche bei gewissen äusseren Gegebenheiten zum Ausbruch der Krankheit führen. Pränatale Amniozentese erlaubt DNA-Untersuchung (Southern Blot).

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