Theoretische Grundlagen
- Die Reaktion muss vollständig ablaufen; ΔG sollte in dem Fall sehr negativ sein.
Allenfalls aus energetischen Gründen eine nachgeschaltete Reaktion sinnvoll.
ΔG = ΔG° + RT ln (B/A).
- Photometrische Messung durch Kopplung der Reaktion an Oxidation bzw. Reduktion von NAD+ oder NADPH/H+. Nur NADH bzw. NADPH weisen bei 340 nm ein zweites Absorptionsmaximum
auf (bedingt durch Veränderung
der Molekularstruktur – Doppel-bindungen!).
- Um die Inkubationszeit kurz zu halten und ein aussagekräftiges Resultat zu erhalten, werden Hilfssubstrate und Enzyme im Ueberschuss verwendet.
Vollständiger Ablauf der Reaktion, wenn
Extinktion konstant bleibt.
- Die Inkubationstemperatur hat nur einen Einfluss auf die Reaktionszeit, nicht aber auf die Produktemenge (Achtung: thermolabile Enzyme!).
ΔG = ΔG° + RT ln (B/A) und ΔG = DH - TDS
Glucose-Bestimmung nach der Glucoseoxydase | Peroxidase Methode (GOD|POD)
Prinzip:
Glucose wird durch Glucoseoxydase (GOD - bakterielles Enzym) oxydiert. Der Wasserstoff wird zunächst auf FAD, dann auf molekularen Sauerstoff übertragen, sodass für jedes oxydierte
Glucosemolekül ein H2O2 entsteht. Dieses wird durch eine Peroxidase (POD) zur Oxidation von ABTS verwendet. ABTS ist in reduziertem Zustand farblos, in oxydiertem Zustand dagegen lichtabsorbierend,
d.h. farbig. Die Menge des entstehenden Farbstoffs kann photometrisch bestimmt werden.
Reaktionsschema:
Glucose + GOD (FAD-Enzym) › Gluconsäure + red GOD (FADH2-Enzym) (Oxidase)
GOD (FADH2-Enzym) + O2 › H2O2 + GOD (FAD-Enzym) (Oxidase)
H2O2 + red ABTS (farblos) › ox ABTS (grünblau) + 2 H2O (Peroxidase) Total: 1 Glucose + 1 O2 + 1 red ABTS › 1 Gluconsäure +
2 H2O + 1 ox ABTS
Definitionen:
- Oxidasen sind Oxidoreduktasen, die Elektronen bzw. Wasserstoff direkt auf molekularen Sauerstoff übertragen, wobei als Produkte das oxidierte Substrat plus H2O oder H2O2 entsteht.
- Peroxidasen übertragen
Wasserstoff direkt auf H2O2 und reduzieren dadurch H2O2 zu H2O.
- Dehydrogenasen sind Oxidoreduktasen, die den Wasserstoff auf NAD+ übertragen.
Resulat:
- Ablesen der Glucose-Konzentration anhand Standartkurve (Extinktion gegen Blindwert messen).
- Konzentrationsberechnung:
[E (Analyse) / E (Standart)] x Konzentration Standart = x (Analyse) [Glucose/ L Serum]
Fehlerquellen:
- GOD / POD – Methode ist weitgehend Glucose-spezifisch, nur Mannose würde auch reagieren.
- H2O2 ist sehr labil (!)
- Substanzen, die H2O2 reduzieren (Vitamin C, Hämoglobin) oder zerstören (Katalasen) ergeben zu tiefe Werte. Vitamin C kein Problem im Blut, da zu tiefe Werte;
dagegen kann im Harn die Vitamin C – Konzentration nach entsprechender Ernährung hoch sein und Messung verfälschen.
Vitamin C: Ascorbinsäure + H2O2 › Dehydroascorbinsäure + 2 H2O
Katalase: 2 H2O2 › 2 H2O + O2
Peroxidasen und Katalasen kommen normalerweise nur intrazellulär vor, können aber nach Gewebeschädigung ins Blut übertreten.
Bestimmung der Glucose nach der Hexokinase-Methode Reaktionsschema:
Glucose + ATP › Glucose-6-P + ADP (Hexokinase)
Glucose-6-P + NADP+ › Gluconolacton-6-P + NADPH/H+ (Glucose-6-P-DH) Total: 1 Glucose + 1 ATP + 1 NADP+ › Gluconolacton-6-P + 1 ADP + 1 NADPH / H+
Anmerkungen:
- Die Hexokinase-Method ist spezifischer als die GOD/POD-Methode, aber rel. teuer.
- Die hier verwendete G6P-DH arbeitet auch mit NAD+, während die in unserem Körper nur mit NADP+ funktioniert.
- Referenzwerte beim Erwachsenen:
- Nüchtern: 3,6 – 6,1 mMol/l Serum
- Postprandial: < 11 mMol/l Serum
- Diabetes mellitus: > 7,8 mMol/l Serum (nüchtern)
Auswertung:
Extinktion gegen Blindwert messen
c = E x (1 / e d) x Verdünnung (!) Fehlerquellen:
Pentosephosphatweg-Enzyme: nach Gewebeschädigung können weitere Enzyme des Pentosephosphatweges ins Blut übertreten, welche Gluconsäure zu Ribulose-5-Phosphat oxydieren, wobei
weiteres NADP+ zu NADPH reduziert wird. Es werden in diesem Fall zu hohe Blutglucosewerte gemessen. Bestimmung der Blutglucose mit Glucometer
Das Vermeiden oder Herauszögern von Langzeitfolgen bei Diabetes mellitus erfordert, dass der Blutzuckerspiegel möglichst in den normalen Grenzen bleibt. Dies erfordert, dass die halbtäglich
eingespritzte Insulinmenge genau auf den aktuellen Blutglucosespiegel abgestimmt ist. Daher die Notwendigkeit, diesen Spiegel täglich auf einfache Weise zu bestimmen – mit Teststreifen
(GOD / POD – Methode). |
