GOT, GPT, CK und CK-MB, Saure Gesamt- und Prostata-Phosphatase
Allgemeines:
Enzymaktivitätsmessung ist ein wichtiges Hilfsmittel zur Erfassung und Ueberwachung zahlreicher Krankheitszustände. Bei Erkrankungen der Leber, des Herzens und des Pankreas sind die Ergebnisse
von Enzymbestimmungen oft unentbehrlich für Diagnose, Differential-diagnose, Verlaufs- und Therapiekontrolle. Herkunft der Serumenzyme:
- Zelluläre Enzyme. Nur bei Schädigun des Herkunftorgans ist ihre Konzentration
im Plasma erhöht.
- Sekretierte Enzyme:
- Enzyme exokriner Drüsen; sie haben im Blutplasma keine
biologische Funktion. Nur bei Schädigung des Herkunftorgans
ist ihre Konzentration im Plasma erhöht.
- Enzyme des Pankreas (Amylase, Lipase)
- Enzyme der Parotis (Amylase)
- Plasmaspezifische Enzyme; von der Leber ins Plasma
abgegeben, ist ihr Hauptwirkungsort das Plasma. Bei
Schädigung des Herkunftorgans ist ihre Konzentration
erniedrigt.
- Diagnose: Nur bei erhöhter Konzentration eines organspezifischen Enzyms, kann der Krankheitsherd genau lokalisiert werden, ansonsten müssen wir das Enzym-Muster
und die Isoenzym-Typen in unsere Betrachtungen einbeziehen.
- Enzymmuster: mengenmässiges Verhältnis (Enzymquotient)
der verschiedenen intrazellulären Enzyme ist organspezifisch.
- Isoenzyme: organspezifischer Enzym-Typ.
Technisch Bemerkungen:
- Die Enzymkonzentration kann auf zwei Arten gemessen werden:
- Messung der Enzymaktivität mit Hilfe eines enzym-
spezifischen Substrats. (Diese Methode erfasst nur native,
enzymatisch aktive Proteine.)
- Quantifizierung der Menge des Enzymproteins mit enzym-
spezifischen Antikörpern. (Immunologische Methode erfasst
auch denaturierte Enzyme oder Enzymbruchstücke.)
- Faktoren, welche die Enzymaktivität positiv oder negativ beeinflussen können, müssen konstant gehalten werden: pH, Inkubationstemperatur, allosterische Substanzen.
- Hohe Substratkonzentration,
damit Vmax gewährleistet ist (auch bei sehr hohen Enzym-konzentrationen!) und keine Rückreaktionen stattfinden.
- Angabe der Enzymkonzentration in Aktivitätseinheiten, da wir
nicht wissen, wie viele Enzyme in der aktiven Form sind und wie gross die Inhibitoren- bzw. Aktivatoren-konzentration ist – normalerweise
ist der Grossteil der Enzyme inaktiv! (I.U./L = mmol/min/L) Achtung: eine krankheitsbedingte Zu- oder Abnahme der Aktivatoren bzw. Inhibitoren kann eine Aktivitätsänderung ohne echte Konzentrationsänderung
des Enzyms hervorrufen.
- Bestimmung des Substratumsatzes durch Bestimmung der Substratabnahme bzw. Produktzunahme. Meist wird eine Oxidation bzw. Reduktion an die eigentliche Reaktion gekoppelt,
um die Ab- bzw. Zunahme von NADH/H+ bzw. NADPH/H+ als Substratumsatz messen zu können. Oder aber es wird ein Substrat gewählt, dessen Absorptionsspektrum sich bei der Umwandlung in ein
Produkt verändert.
- Gekoppelte Enzymreaktionen:
- Enzym X muss geschwindigkeitsbestimmend sein.
- Alle Substrate müssen in hohen Konzentrationen vorliegen.
- Weitere Enzyme müssen in genügend grossen Konzentrationen
vorliegen, um nicht die Reaktionsabfolge zu behindern.
- DG der Gesamtreaktion muss negativ sein!
- Stabilität der zellulären Enzyme im Serum: Durch den Uebertritt eines Zellenzyms in den extrazellulären Raum kann sich seine Aktivität
verändern (im spez. Enzyme, die Cystein
enthalten – Disulfidbrücken, da kein Reduktionsschutz (z.B. Glutathion) im Serum vorhanden ist!). Durch „Reaktivierung“ lassen sich allfällige Aktivitätseinbussen wieder
rückgängig machen.
- Normalwerte variieren je nach Methode, da unterschiedliche Puffer und Substrate verwendet wurden. Temperatureinfluss!
- Hämolytisches Serum: Gefahr auf Verfälschung durch Enzyme
der Blutbestandteile. Deshalb hämolysefreies Serum verwenden!
Versuch 1:
Bestimmung der Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) = Aspartataminotransferase (ASAT) im Serum (Pyridoxalphosphat-abhängig!).
- Messprinzip: a-Ketoglutarat + Aspartat › Glutamat + Oxalacetat (GOT)
Oxalacetat + NADH/H+ Malat + NAD+ (MDH)
Transaminaseaktivität kann photometrisch durch die Abnahme der NADH/H+-Extinktion bestimmt werden.
- Auswertung: Graphik: Absorption – Inkubationszeit
DE/min berechnen; Mittelwert im linearen Bereich
- Vorkommen der GOT: Im Zytoplasma wie in den Mitochondrien der Leber, Herz- und
Skelettmuskulatur. Im Serum kommt GOT praktisch nicht vor. Besonders stark steigt die GOT-Aktivität im Serum dagegen bei Herzinfarkt, infektiöser Gelbsucht (Hepatitis) und bei Leberschädigung
durch Gifte. Auch bei degenerativer Muskeldystrophie oder bei ausgedehnten Muskeltraumen sind die GOT-Werte häufig erhöht, aber nicht so stark wie bei Herzinfarkt oder Hepatitis.
- Rolle
der GOT und GPT im Stoffwechsel:
- Stickstoff-Stoffwechsel (Uebertragung auf a-Ketocarbonsäuren)
- Aspartat-Zyklus und Harstoffbiosynthese
- Alanin-Glucose Zyklus
- Krebszyklus und Gluconeogenese aus glucogenen Aminosäuren
Versuch 2:
Bestimmung der Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) = Alaninaminotransferase (ALAT) im Serum (Pyridoxalphosphat-abhängig!)
- Messprinzip: L-Alanin + a-Ketoglutarat › Pyruvat + Glutamat (GPT)
Pyruvat + NADH/H+ › Lactat + NAD+ (LDH)
Transaminaseaktivität kann photometrisch durch die Abnahme der NADH/H+-Extinktion bestimmt werden.
- Monotest: Alle Reagenzien (Puffer, Substrate und Hilfsenzym) sind in einem
kleinen Fläschchen in getrockneter Form vereinigt – käuflich.
- Auswertung: analog GOT
- Vorkommen der GPT: Während die GOT sowohl im Zytoplasma wie in den
Mitochondrien der Zelle vorliegt, ist die GPT nur im Zytoplasma der Zelle vorhanden. Das enzymreichste Organ ist die Leber; es folgen in weitem Abstand Skelett- und Herzmuskel.
Starker Anstieg der Enzymkonzentration bei akuten Lebererkrankungen (spez. bei infektiöser Hepatitis – Gelbsucht); geringere Erhöhung bei chronischen Lebererkrankungen und bei Herzinfarkt.
Der Quotient GOT/GPT liegt im Serum normalerweise zwischen 1 und 1,4. Wird dieser Quotient kleiner als 1, so deutet dies auf eine akute Erkrankung der Leber hin, während bei einer chronischen
Erkrankung diese Organs und Uebergang in Lebercirrose auch ein Quotient von >1 auftreten kann. Dagegen ist bei Herzinfarkt der GOT/GPT-Quotient stark erhöht (>>1).
Versuch 3:
Bestimmung der Kreatinkinase
- Kreatinkinase: Kreatinphosphat + ADP › Kreatin + ATP
Regeneration von ATP im Muskel
3 Isoenzym-Typen: - CK-MM - Skelettmuskeltyp
- CK-BB - Gehirntyp
- CK-MB - Herzmuskeltyp
CK-BB-Aktivitäten sind im Blut nicht nachweisbar. Daher ist bei erhöhter Gesamt-CK im Serum die Messung von CK-MM und und CK-MB zur Differenzierung von Herz- und Skelettmuskelschäden
von Bedeutung.
- Messprinzip: Kreatinphosphat + ADP › Kreatin + ATP (CK)
ATP + Glucose › ADP + Glucose-6-Phosphat (Hexokinase)
Glucose-6-Phosphat + NADP+ ›
Gluconolacton-G-Phosphat + NADPH/H+ (G-6-PDH)
Gesamt-Kreatinkinaseaktivität kann photometrisch durch die Zunahme der Extinktion von NADPH/H+ bestimmt werden.
- Bestimmung der Aktivität von CK-MB: Einsatz von Antikörpern gegen
CK-M-
Untereinheit. Es wird vorausgesetzt, dass das Isoenzym CK-BB im Serum nicht vorhanden ist (Normalfall!). Da CK-M- und B-Untereinheiten unabhängig voneinander gleiche Umsatzgeschwin-digkeiten
besitzen, kann durch Multiplikation des Messergebnisses mit dem Faktor 2 die CK-MB-Aktivität des Serums ermittelt werden.
Klinik:
Zeitlicher Ablauf der Erhöhung von CK, CK-MB, GOT, GPT und LDH im Serum nach Herzinfarkt
Nach Infarkt steigt CK im Serum innert 24 h an und geht normalerweise innert 48-72 h auf Normalwerte zurück. LDH steigt erst 24-48 h nach dem Infarktgeschehen an, bleibt aber danach 7-14 Tage
lang erhöht. Der zeitliche Ablauf des Anstiegs und Abfalls von GOT und GPT ist intermediär. Die Herkunft des LDH aus dem Herzen kann durch Isoenzymanalyse bestätigt werden.
Versuch 4:
Bestimmung der Aktivität der sauren Phosphatase und der Prostata-Phosphatase im Serum
- Allgemeines: Phosphatasen katalysieren die hydrolytische Spaltung von Phosphor-
säureestern. Wir unterscheiden saure und alkalische Phosphatase.
Die sauren Phosphatasen des Serums sind ein Gemisch von 5 Isoenzymen. Sie stammen vorwiegend aus Thrombozyten, Erythrozyten, Knochen und der Prostata.
Die saure Prostata-Phosphatase-Aktivität ist von Bedeutung für die Verlaufskontrolle des Prostatakarzinoms. Sie kann von den anderen sauren Phosphatasen gesondert erfasst werden, da sie
im Gegensatz zu den meisten anderen sauren Phosphatasen durch Tartrat hemmbar ist. Tartrat-hemmbar ist allerdings auch die Aktivität der Thrombozyten-SP, sodass diese Messung nicht absolut
spezifisch für das Prostataenzym ist.
- Fehlerquellen: Im Serum werden höhere Werte als im Plasma gemessen, da bei
Blutgerinnung saure Phosphatase aus Thrombozyten freigesetzt wird, was als scheinbare Erhöhung der Prostata-Phosphatase gedeutet werden könnte.
Verwendung von hämolytischen Seren bewirkt erhöhte Werte der Gesamtmenge an saurer Phosphatase, da saure Phosphatase aus den Erythrozyten freigesetzt wird.
Prostata-Palpationen, rektale Untersuchungen und Katheterisierung bewirken eine vorübergehende Erhöhung der Aktivität der Prostata-Phosphatase im Serum.
- Indikation: Diagnose und
Verlaufskontrolle. Zur Früherkennung allerdings nicht
geeignet, da erst im fortgeschrittenen Karzinom-Stadium Konzentra-tionserhöhungen eintreten.
- Messmethode: Substratumsatz kann photometrisch gemessen werden.
- Bemerkungen: Prostata-Phosphatase-Aktivität kann auch durch Antikörperblockierung
oder mit einem Radioimmunoassay (RIA) bestimmt werden.
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Bestimmung von Serumenzymaktivitäten