Elisa und Radioimmunoassay
Einführung:
Die Erkenntnisse über die Wechselwirkungen von Antigen und Antikörper haben zu Methoden zur Diagnose von Infektionskrankheiten und zur Identifizierung von infektiösen Agentien geführt.
Ebenfalls lassen sich zahlreiche biologische Produkte wie z.B. Proteine, Enzyme, Hormone, Vitamine und Medikamente erkennen und auf elegante Art messen. Antigen wird zum Nachweis von Antikörpern
benutzt und umgekehrt.
Für die Bindung zwischen Antikörper und Antigen sind die gleichen Kräfte verantwortlich wie für die Enzym-Substrat- oder Hormon-Rezeptor-Bindung, d.h. Wasserstoffbrücken,
van der Waal’sche Kräfte, hydrophobe Wechselwirkungen sowie elektrostatische Kräfte, deren Stärke durch pH und die Ionenstärke des Mediums beeinflusst wird.
Allgemeines:
- Radioimmunoassay – RIA
- Enzym linked immunosorbent assay – ELISA
Es stehen eine markierte und eine unmarkierte Version eines Antigens in Konkurrenz um die Bindungsstelle auf einer limitierenden Menge von Antikörpern. Je mehr unmarkiertes Antigen vorhanden
ist, desto weniger markiertes Antigen reagiert mit den Antikörpern. Der Ansatz erlaubt so die Menge unmarkierten Antigens zu bestimmen.
Vorerst wird in verschiedenen Ansätzen mit variablen Mengen von Antigen X aber konstanten Konzentrationen an markiertem Antigen und Antikörpern eine Standartkurve erstellt. Anschliessend
wird der Versuch mit der unbekannten Antigenprobe (Analysenprobe) durchgeführt und das Resultat von der Standartkurve abgelesen.
Da die Verwendung von radioaktiven Isotopen nicht ganz einfach und zudem auch teuer ist, werden heute bevorzugt Antikörper oder Antigene benutzt, die durch kovalente Bindung an Enzyme
markiert sind (Enzymimmunoassay).
Am einfachsten ist die Bestimmung, wenn einer der Komponenten, Antigen oder Antikörper, fixiert ist (solid phase). Somit kann nach Auswaschung die Radioaktivität bzw. Enzymaktivität
leicht gemessen werden.
Die verschiedensten Versuchsanordnungen sind möglich.
Oft werden trägergebundene Antikörper auch verwendet, um die zu analysierende Substanz rasch aus einer grossen Menge von Analysengut zu konzentrieren und somit die Effizienz der nachfolgenden
Messung mit radio- bzw. enzymmarkierten Liganden zu erhöhen.
Radio- und enzymimmunologische Bestimmungsmethoden sind relativ spezifisch und vor allem ausserordentlich empfindlich. Es können Stoffe in Konzentrationen bis 10-12 M nachgewiesen werden. Bestimmung des IgG-Gehaltes von Rinder-Serum
Testprinzip:
- Rinder-IgG wird auf Plastikoberfläche gebunden
- Plastikoberfläche wird mit BSA (Bovine serum albumin) gesättigt
- Testserum (Rinderserum oder foetales Kälberserum) wird zugegben
- Der an alkalische Phosphatase gekoppelte, gegen Rinder-IgG gerichtete Antikörper wird zugegeben. Dieser Antikörper
wurde durch Injektion von Rinder-IgG in ein Kaninchen erzeugt.
- Nach der Inkubation Auswaschung
- Die Menge des zurückgebliebenen Antikörpers wird durch Messung der alkalischen Phosphatase bestimmt.
- Photometrische Messung der umgesetzten Substratkonzentration im ELISA-Reader.
Versuch:
- Wir erstellen mit Hilfe einer Verdünnungsreihe eine Standartkurve, mit der wir spätere Werte vergleichen können.
- Vergleich IgG-Gehalt in foetalem und adultem Rinderserum
Komplement-System
Allgemeines:
Das Komplement-System ist Teil der humoralen Immunabwehr des Körpers. Ueber 20 Serumproteine sind daran beteiligt. Am Ende einer langen Reaktionskaskade entsteht ein ‚membrane attack complex‘,
der zur Zerstörung (Bakteriolyse) des Fremdkörpers (Virus, Bakterien, Tumorzellen etc.) führt. Zudem aktiviert das Komplement-System auch Effektorzellen der unspezifischen Immunabwehr.
Ausgelöst wird das Komplement-System durch die Erkennung von Antigenen durch Antikörper. Testverfahren der Komplement-Titration:
Die Aktivität des Komplement-Systems wird durch die Membranlyse (durch Porenbildung) von mit Antikörpern markierten Erythrozyten gemessen. „Sensibilisierte“ Erythrozyten (bedeckt
mit Antikörpern, IgG und IgM, die gegen die Erythrozytenoberfläche gerichtet sind) werden mit dem zu testenden Serum gemischt. Das Komplement-System führt zur Membranauflösung
der Erythrozyten. Die photometrische Messung des freigesetzten Hämoglobins erlaubt die Messung der Aktivität des Komplement-Systems. Wieviel Prozent aller Erythrozyten wurde zerstört?
Am genausten ist die Messung im Bereich der „complement hemolysis 50 unit“ – im halbmaximalen Bereich.
Versuch: Wir erstellen mit Hilfe einer Verdünnungsreihe eine Standartkurve, mit der wir spätere Werte vergleichen können. |
