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Bestimmung des Einflusses von Substratkonzentration, pH, Inkubationstemperatur und Inhibitoren auf den Substratumsatz pro Minute am Beispiel der alkalischen Phosphatase.

Allgemeines:

  • Enzymeigenschafts-Analysen werden wenn möglich an gereinigten Enzymen durchgeführt – erleichtert Interpretation (Bsp: stimulierende Wirkung von Ca2+ auf gereinigtes Enzym oder Enzym im Serum).
  • Messung der Initialgeschwindigkeit, da mit abnehmender Substrat-Menge die Geschwindigkeit nachlässt – im Bereich des Reaktionsgleichgewichtes (dA/dt = 0).
    Kinetische Messmethode: kontinuierliches oder regelmässiges Messen des Substratumsatzes.
  • Alkalische Phosphatase – Enzym mit pH-Optimum im alkalischen Bereich.
  • Michaelis-Menten-Modell: E + S ES E + P
    • Die Reaktion ES E + P ist geschwindigkeitsbestimmend.
    • Nur Initialgeschwindigkeit wird berücksichtigt.
    • Michaelis-Menten-Konstante: Km = (k2 + k3) / k1
    • Ist die Substratkonzentration so hoch, dass alles Enzym im System als ES-Komplex vorliegt, so ist die max. Geschwindigkeit Vmax erreicht.
      Vmax = k3 (Etot)
    • Die Michaelis-Menten-Konstante gibt Auskunft über die Substratkonzen-tration bei halbmaximaler Geschwindigkeit – Indiz für Enzymaktivität.
    • Lineweaver-Burk plot: Graphische Bestimmung von Km und Vmax (Ordinate: 1/v ; Abszisse: 1/Substrat); Steigung der Gerade: Km / Vmax.
    • Graphik: Initialgeschwindigkeit – Substratkonzentration; sigmoidale Kurve nur bei allosterischen Enzymen (z.B. Hämoglobin – allosterisch bedeutet, nach erster Bindung veränderte Aktivität), sonst hyperbelförmige Kurve!
  • Inhibitoren können die Enzymreaktion so beeinflussen, dass entweder nur Km oder nur Vmax oder aber beide Parameter scheinbar verändert werden.
    Inhibitoren, die an die Substratbindungsstelle binden, werden kompetitive Inhibitoren genannt. Sie sind oft Struktur-Analogon des natürlichen Substrats (Vanadat hat gleiche Struktur wie PO32-, nur ist Phosphat durch Vanadium ausgetauscht). Bei kompetitiv gehemmten Reaktionen ist nur Km erhöht, Vmax bleibt unverändert.
    Nicht-kompetitive Inhibitoren binden ausserhalb der Substratbindungsstelle. Sie verändern Vmax, Km bleibt dagegen unverändert.
    Gewisse Inhibitoren beeinflussen sowohl Km als auch Vmax.
  • Vmax ist nicht eine absolute Grösse, da sie von der Enzymmenge, der Fraktion aktiven Enzyms, der Temperatur und der Art des Puffers abhängt. Vmax steigt mit zunehmender Temperatur (van’t-Hoff Regel). Mit weiter steigender Temperatur nimmt Enzymaktivität dagegen wieder ab – Denaturierung der Proteine.

Messprinzip:

Umsetzung eines Stoffes, dessen Produkt photometrisch messbar ist

Versuche:

  • 1.Versuch: Bestimmung des pH-Optimums
  • 2. Versuch: Einfluss der Inkubationstemperatur
  • 3. Versuch: Bestimmung von Vmax und Km für die alkalische Phosphatase
  • 4. Versuch: Inhibition der alkalischen Phosphatase durch Vanadat

Bemerkungen:

  • Enzymaktivität in mmol/min = I.E. (internationale Einheiten)
  • Van’t-Hoff Gleichung: k = A e -ΔG*/RT
    k: Geschwindigkeitskonstante
    A: Häufigkeit zur Reaktion führender Zusammenstösse
    ΔG*: Aktivierungsenergie
  • Versuch 2: Aktivitätserhöhung bzw. Temperaturkoeffizient = E(38°C) / E(25°C);
    sollte etwa 2 – 3 betragen, da Temperaturdiff. 10°C.

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